本文建立了一种高效液相色谱法测定微生物发酵液中四氢嘧啶含量的方法。通过对不同色谱柱的筛选，最终发现Shim-pack Scepter Diol-HILIC-120(4.6 x 250 mm, 5 μm)对于四氢嘧啶有较好的保留和分离能力。四氢嘧啶在0.1-2 mg/mL浓度范围内线性良好，相关系数＞0.9999。浓度为0.2 mg/mL的校准点连续5次进样保留时间RSD%为0.104%，峰面积RSD%为0.542%，重复性良好。