本文建立了在线凝胶色谱串联三重四极杆气质联用仪GPC-GC-MS/MS同时测定烟草中127种农药残留的分析方法。以QuEChERS技术快速提取烟草中残留农药，经过在线GPC净化烟草中的色素、生物碱等大分子物质，通过串联质谱的MRM方式，有效降低复杂基质干扰及农药组分重叠的相互串扰。在0.001~0.1 mg/L的浓度范围内，农药的线性相关系数均在为0.999以上，对0.005 mg/L的标准溶液连续6针进样，峰面积的RSD%在5%以下。在0.05 mg/kg的加标浓度下，加标回收率在70~100%之间，多数农药的最低检出限为0.001mg/L以下，完全满足日常监测对烟草中农药测定要求，为烟草中农残检测提供了一个快速、简便、准确的测定方法提供借鉴。